علوم آزمایشگاهی | Lab sciences

علوم آزمایشگاهی ، مطالب آزمایشگاهی ، معرفی تکنیک ها و روشهای آزمایشگاهی برای شناسایی بیماری هاو ...

اولین سل کانتر

 

از اين دستگاه براي اندازه‌گيري پارامترهاي خوني به صورت كمي استفاده مي‌كنند . وظيفه اصلي اين دستگاه ها تهيه گزارش سريع و دقيق به روشي ساده از پارامترهاي اصلي خون است ، به نحوي كه نمونه هاي غير طبيعي يا بلاست از نمونه هاي طبيعي تفكيك گرديده و جهت انجام بررسي هاي بيشتر آنها از روش هاي متداول ديگر كمك گرفته مي شود .


وظیفه اصلی این دستگاهها تهیه گزارش سریع و دقیق به روشی ساده از پارامتر‌های اصلی خون است، به نحوی که نمونه‌های غیر طبیعی از نمونه‌های طبیعی تفکیک گردیده و جهت انجام بررسی‌های بیشتر آنها از روش‌های متداول دیگر کمک گرفته می‌شود.سل کانتر از دو واژه سل (سلول) و کانت (شمارش) تشکیل شده است . استفاده از این دستگاه ها امروزه پیشرفت خوبی داشته است ولی بعد از 25 سال از تولید نسل جدید این دستگاه ها هنوز هیچ شرکتی نتوانسته است سیستمی مانند سیستم های شرکت سیسمکس را به بازار عرضه کند که توانایی اندازه گیری اندیکس های داخل گلبول های قرمز را دارند . روش دستی هم در کنار این روش اتوماتیک برای کالیبراسیون استفاده می شود . هر چند که این دستگاه ها یکی از ملزومات آزمایشگاه های امروزه هستند و با دقت بالا کار می کنند اما باز هم ممکن است جواب به دست آمده از نتایج واقعی دور باشد اما این عیب هم باعث عدم استفاده از این دستگاهها نمی شود . در کذشته سل کانتر ها بر اساس اندازه ، سلول ها را شمارش می کردند اما امروزه از روش های جدیدی مانند اسکاتر استفاده می شود . انواع مختلفی از این نوع دستگاهها وجود دارد که از روش های مختلفی برای اندازه گیری و شمارش سلول ها استفاده می شود اما تقریبا تمام آنها از یکی از چهار روش معرفی شده استفاده می کنند امپدانس (روش امپدانس الكتريكي-تغيير در هدايت الكتريكي) ، اپتیکال (الكترواپتيكال) ، سیتوشیمیکال و تلفیقی .


روش امپدانس به علت سهولت و مزایایی نسبتا خوبی که دارد بیشتر استفاده می شود .  سل کانتر های اپتیکال توسط نور و قوانین حاکم بر ان اندیکس های هماتولوژی را گزارش می کند .سیتوشیمی هم روشی است که به طور انحصاری در دستگاه های شرکت بایر استفاده می شود . شرکت های مختلف و با نام های تجاری گوناگون در سراسر جهان انواع این دستگاه ها را با متد های گوناگون به بازار عرضه می کنند از مهمترین انها می توان به شرکت های Sysmex ، Abbott ، ABX و ... اشاره کرد . در میان شرکت های فوق فقط دستگاه 25 ساله مربوط به شرکت سیمکس به نام H1 توانایی های بسیار قوی نسبت به سایر دستگاه ها دارد و به همین منوال هم سهم بیشتری از بازار را به خود جذب کرده است . 

  • در ادامه چهار روش مورد استفاده در سل کانتر ها را بررسی می کنیم :
  • 1. روش امپدانس : 
    امپدانس الكتريكي عمده‌ترين روش به‌كار گرفته‌شده در تحليل‌گرهاي هماتولوژي است. در اين روش سلولهاي خوني (ذرات بيولوژيك نارسانا) در يك رقيق‌كننده هادي جريان الكتريكي (الكتروليت) معلق شده و سپس به داخل روزنه شمارش يك استوانه شيشه‌اي كشيده مي‌شود. در محفظه شمارش يك جريان الكتريكي با فركانس پايين (حريان مستقيم)بين الكترودهاي خارجي كه در دو طرف روزنه در الكتروليت معلق است، برقرار است. هنگامي‌ كه يك سلول خوني از منطقه حساس روزنه عبور مي‌كند، باعث تغيير ولتاژ جريان الكتريكي شده و ايجاد يك پالس الكتريكي مي‌نمايد كه اندازه آن متناسب با حجم سلول است. سل‌كانترهايي كه براساس امپدانس الكتريكي عمل مي‌كنند داراي دو كانال جهت شمارش سلولها است: - كانال شمارش اريتروسيت / پلاكت - كانال شمارش لكوسيت‌ها.

    2. روش‌هاي اپتيكال (نوري) 
    فن‌آوري الكترواپتيكال، صرف نظر از روش خاص بكار گرفته شده اساسا بر واكنش متقابل نور و ماده استوار است. هنگامي كه يك پرتو نوري به جسمي كه داراي ضريب شكست (دانسيته) خاصي است برخورد كند به چند حالت در مي‌ايد . منبع نوري به‌كار گرفته شده در دستگاه‌ها غالبا يك لامپ تنگستن-هالوژن يا يك ليزر نيمه هادي (نظير ليزر نئون-هليوم) است. در اين فن‌آوري سوسپانسيون رقيق شده سلول‌هاي خوني به داخل جريان پيوسته‌اي از محلول الكتروليتي تزريق مي‌شود. جريان پيوسته و غلافي شكل محلول الكتروليتي باعث هدايت و عبور سلول‌ها به صورت تك رديفي (فلوسل) از كانال فلوسل (Flow cell) مي‌شود. در اين كانال سلول‌ها در محل خاصي از مقابل منبع نوري عبور كرده و مورد اصابت پرتوهاي نوري قرار مي‌گيرد. بسته به نور موجود و وضعيت سلول، نور اصابت كرده به سلول ممكن است جذب شود، برگشت پيدا كند (بازتابش)، در جهت‌هاي گوناگوني پراكنده شود و. . . . در اين سل‌كانترها، آشكارسازهاي نوري (فتودتكتورها) Photodetectors))خاصي جهت شناسايي و تبديل پرتوهاي پراكنده شده به سيگنال‌هاي الكتريكي، تعبيه شده‌ است .

    3. تحليل‌گرهاي تلفيقي (هيبريد)
    روش‌هاي امپدانسي و اپتيكال با وجود مزاياي متعدد، هريك داراي محدوديت‌هايي است كه كارايي آنها را تحت تأثير قرار مي‌دهد. به منظور رفع اين محدوديت‌ها و دستيابي به فن‌آوريهاي برتر در شمارش سلولي، شركت‌هاي سازنده تحليل‌گرهاي هماتولوژي به‌ تدريج به سمت به‌كارگيري روش‌هاي تلفيقي روي آوردند كه اين امر منجر به افزايش كارايي تحليل‌گرها و نيز صحت پاسخ‌هاي حاصل از آنها شده است. از جمله اين روش‌هاي تلفيقي مي‌توان به روشهاي RF/DC و VCS اشاره نمود .

برسی ساختمان و عملکرد دستگاه شمارش گر H1
همان طور که احتمالا متوجه شدید مدل H1 یکی از موفق ترین مدل های آنالیزور های هماتولوژی میباشد ما هم در ادامه این دستگاه را معرفی خواهیم کرد . 

ساختمان H1
الف ) واکنش سیتوشیمیایی یا آماده سازی
ب ) فلوسل : سنجش ابعاد
ج)کانورتر : تبدیل خرجوی دستگاه به اعداد

کانال های دستگاه H1
در این دستگاه چهار نوع کانال یا دریچه تعبیه شده است که هر کدام مربوط به عملکر خاصی هستند . 
کانال های شامل کانال های گلبول های قرمز ، پلاکت ، پراکسیداز و هموگلوبین است . باید توجه کرد که در سل کانتر ها ابتدا سه اندیکس هموگلوبین ، هماتوکریت و MCV به دست می آید و با استفاده از انها می توان سایر اندیکس ها را به دست اورد . سه کانال اولی از روش فلوسایتومتری استفاده می کنند ولی کانال آخری (هموگلوبین) از روش رنگ سنجی استفاده می کند . 

 کانال هموگلوبین 


روشی که برای اندازه گیری هموگلوبین در سل کانترها استفاده می شود همان روش سیان متهموگلوبین معمولی است که به صورت روتین در آزمایشگاه ها استفاده می شود اما همان طور که می دانید این روش به مدت زمان زیادی نیاز دارد . در دستگاه های سل کانتر برای کاهش این زمان از همین روش استفاده می شود ولی با مقداری تغییرات تا زمان آزمایش کاهش یابد . در سل کانتر 2 میکرولیتر خون با 500 میکرولیتر خون مخلوط شده و زمان نیز هم با کاهش مقادیر ، کاهش میابد . 

  • محلول کار مورد استفاده سورفاکتانت غیر یونی و سیانید پتاسیم است . سورفاکتانت غیر یونی برای لیز گلبول ها در اولین ثانیه و سیانید برای تولید هموگلوبین غیر قابل بازگشت استفاده می شود . 

در این روش باید به یک نقطه توجه کرد آن هم این است که هم درون گلبول های قرمز و درون ساختارهای پورفرینی است بنابراین این هم برای انجام سریع واکنش باید خیلی سریع آزاد شود و در اختیار محلول کار قرار گیرد تا سیانومتهموگلوبین به دست آید . برای این کار از محلول "لوریل دی متیل آمین اکسید" استفاده می شود . این محلول گلبول های قرمز را مانند مکانیسم بادکندکی میترکاند و باعث کاهش زمان آزمایش به زیر 10 ثانیه می شود . 


بعد از مخلوط شدن هموگلوبین با محلول کار ، (به غیر از سولفو هموگلوبین) می توان در طول موج 540 نانومتر میزان هموگلوبین را توسط اسپکتوفوتومتر اندازه گیری کرد . 
بعد از اندازه گیری هموگلئبین می توان بر اساس فرمول های زیر میزان MCH و MCHC را به دست اورد که اولی میزان هموگلوبین متوسط در یک گلبول قرمز ولی دومی میزان هموگلوبین در حجم میعنی از گلبول های قرمز (مانند هماتوکریت فرد) است . 


MCH= Hg⁄(RBC Count)
MCHC= Hg⁄HCT


همان طور که توضیح دادیم میزان هموگلوبین در سل کانتر تقریبا مانند روش دستی آن است اما با دقت زیاد و با زمان بسیار کمتر انجام میگیرد . 
فلوسایتومتری روشی است که در دستگاه H1 برای اندازه گیری RBC , PT , PO استفاده می شود . این روش دارای دقت بسیار زیادی است که در ادامه بحث می شود . 




فلوسایتومتری

  •  تعریف : تکنیک مطالعه مشخصات ریز سلول ها است هنگامی که سلول ها یکی پس از دیگری به صورت معلق در مایع سیال به همراه مایع غلیظ تری به نام Sheath از نقطه حساس نوری در داخل سلول می گذرند . کار این مایع غلیظ این است که باعث می شود سلول ها یکی یکی از روبه روی نور عبور کنند .

فلوسایتومتری


تاریخچه مختصر
فلوسایتو متری تکنیکی است با کارآیی بالا که برای اولین بار توسط Wolfgang Göhde در سال 1968 در دانشگاه مونستر کشف شد .نام اولیه این روش "pulse cytophotometry" بود که در کنفرانس 1988 در امریکا به فلوسایتومتری تبدیل شد . 


 مقدمه تکنیک 
 فلوسیتومتری به طور کلی روشی برای شمارش ذرات و بررسی میکروسکوپی ، مانند سلول ها و کروموزوم ها است . در این حالت ذره در یک جریان سیال تعلیق شده و ذره یکی به یکی از مقابل نور عبور میکند و شمارش انجام می شود . همچنین این دستگاه اجازه بررسی multiparametric پارامتر های فیزیکی و شیمیایی را در یک زمان بسیار اندک را می دهد . فلوسیتومتری به طور مداوم در تشخیص اختلالات استفاده می شود ، به خصوص سرطان خون ، اما بسیاری از برنامه های کاربردی دیگر در هر دو پژوهش بالینی و عمل هم شامل ان می شوند . 

 نحوه کار دستگاه
پرتویی از طول موج معین (معمولا نور لیزر ) بر ذرات موجود در یک ماده هیدرودینامیکال تابانده و فوکس می شود . در این قسمت باید استکر را تعریف کرد اصطلاحا :
"به نوری که از درون جسم عبور می کند و از ان ساطع می شود را گویند "
تعدادی دتکتور و یا آشکار ساز در درون دستگاه و در نقطه عبور نور تعبیه شده است . یکی از انها در مقابل و هم خط پرتو نوری است (Forward Scatter or FSC) و دیگری اسکتر جانبی است که به صورت عمود نسبت به منبع نور قرار دارد علاوه بر این ها تعدادی دتکتور فلورسانس دیگری هم در دستگاه تعبیه شده است . اندازه ذرات عبوری از مقابل نور ، 0.2 تا 150 میکرومتر است و اگر ذره ای که دارای ماده شیمیایی فلوروسنت است و یا ماده ای فلوروسنتی است که به ذره متصل شده است ، نور تغییر طول خواهد داد . ترکیب اسکتر و فلوروسنت باعث ایجاد نور مرئی در دتکتور خواهد شد . با برسی میزان درخشندگی و ورش های کامپیوتری میتواند نوع سلول ها و مواد شیمیایی آن ها را برسی کرد . 

 سه اصل مهم در فلوسایتو متری 
الف ) یکنواخت بودن جریان عبور سلول ها 
ب ) یکنواخت بودن غلظت سیال و محلول شیذ
ج ) یکنواخت بودن فشار مکش و ترزیق ذرات


 ساختمان فلوسایتومتر
به طور کلی این دستگاه از 5 قسمت تشکیل می شود :
 جریان مایع یا محلول sheath : کار این مایع غلیظ این است که فلوسل ها به صورت یکی به یکی از مقابل نور عبور می کنند 
 سیستم نوری : معمولا از لامپهای جیوه – زنون استفاده می شود . سایر لیزر ها (دیودی – آرگون – کیریپتون – UV و .. ) هم بنابه نیاز و یا سیستم دستگاه استفاده می شوند . 
 ردیاب (ADC): تبدیل اندیکس های آنالوگی به دیجیتال را انجام می دهد . حالت های اسکتر و آنالیز و تولید زبان دیجیتالی از داده ها توسط این بخش انجام می شود . 
 تقویت کننده سیستم (آمپلیفایر)
 کامپیوتر: برای تجزیه و تحلیل سیگنال
فرایند جمع آوری داده ها توسط فلوسایتومتر " Acquisition " نامیده می شود . Acquisition با اتصال یک کامپیوتر به دستگاه و نرم افزار مربوطه آن انجام می شود . با استفاده از نرافزار می توان پارامتر های مربوط به نوع ذره را تغغیر داد (مانند ولتاژ) . 
دستگاهی که ما برسی کردیم جز حداقلها بود به طوری که امروزه دستگاه های با برند های مختلف وارد بازار شده اند که دارای 4 لیزر و 18 دتکتور فلوروسنت می باشند .

نحوه کار دستگاه فلوسایتومتر

 

مقادیر قابل اندازه گیری توسط فلوسایتو متری در هماتولوژی
 حجم و مورفولوژی RBC
 رنگدانه های سلول
 چرخه DNA , RNA
 تغییرات پروتئین ها 
 برسی CD مارکر های – به ویژه در لوسمی و بیماری های لوکوسیتی
 آنتی ژن های داخل سلولی وحتی هسته ای
 الکترولیت های و PH داخل سلولی
 سیالیت غشا

بعد از اشنایی مختصر با فلوسایتومتری به ادامه بحث خود می پردازیم . در دستگاه H1 اندازه گیری سه کانال باقی مانده یعنی RBC , Pt ,Proxidas توسط روش فلوسایتومتری انجام می شود . 


 کانال RBC – Pt
برای اندازه گیری اندیکس ها از روش Novel استفاده می کنیم که گلبول ها را به صورت ایزولومتریک در میاورد . یعنی تغییری در حجم فلوسل انجام نمی گیرد ولی شکل سلول تغییر می کند . 
باید توجه کرد که :
"گلبول های حاوی HgS در این دستگاه قابل شناسایی نیستند چون این سلول ها به صورت برگشت ناپذیری به حالت داسی شکل تبدیل شده اند "
بعد از عبور فلوسل مورد نظر از جلوی نور (در اینجا گلبول قرمز و یا پلاکت) مقادیر تحت شرایط زیر به دست خواهد آمد : 
 اسکتر در زاویه 2-3 درجه به عنوان حجم
 اسکتر در زاویه 5-15 درجه به عنوان هموگلوبین (مقدار هموگلوبین از این روش هم به دست می آید)
بعد داریم : 
HCT=RBC .c ×MCV
لازم به ذکر این نقطه است که زاویه در پلاکت 30-39درجه است .
همانطور که در آغاز هم گفته شد با دست آوردن سه واحد اصلی مورد نظر ما سایر اعداد و اندیکس ها به دست خواهند آمد . بنابراین به گزارش اندیکس های هموگلوبین (دو روش) و هماتوکریت (با فرمول همین صفحه) و متوسط حجم سلولی (توسط فلوسایتو متر) می تواند سایر اندیسک های مهم را گزارش داد . 

کانال پراکسیداز از این کانال برای برسی گرانول های سیاه موجود در لوکسیت ها استفاده می شود که توسط آنزیم پراکسیداز تولید می شود . برای شناسایی این گرانول ها باید این اجسام توسط رنگ امیزی آشکار شوند . رنگ آمیزی مورد استفاده در این روش رنگ آمیزی "هیدرو پراکسیداز" است که باعث رنگ امیزی گرانول ها به قهوه ای (رنگ ضعیف) و سیاه (رنگ قوی) می شود . 

 روش رنگ آمیزی هیدروپراکسیداز
گلبول های قرمز در حرارت 75 درجه سانتی گراد به طور کامل لیز می شوند تا لوکوسیت ها تنها در نمونه ما باقی بمانند . بعد از این کاری رنگ امیزی شروع می شود . گرانول ها پر اکسیداز دارای انزیم کاتالاز هستند و این انزیم با سوربیتول واکنش می دهد . پس واکنش اولیه ما :
فرم آلدهید + سوربیتول 
ترکیب دو ماده را بر روی لوکوسیت ها قرار می دهیم سپس در ادامه :
آب اکسیژنه + 4 فنول و 1 نفتول = تولید رنگ سیاه
اگر انزیم در گرانول وجود داشته باشد باعث تولید رنگ خواهد شد . 
مانند کانال RBC اسکتر در زاویه 2 درجه حجم و اسکتر در زاویه 5 – 15 درجه میزان انزیم پراکسیداز است . 
 نکته : نتیجه پراکسیداز به صورت دسته جمعی گزارش می شود . 

 سایر کانال ها 
در کانال بازوفیل هم تعدا لوبوله شدن و سیگمانته ها لوکوسیت ها برسی می شود . برای این کار ابتدا گلبول های قرمز را لیز می کنیم . بعد از اینکه سلول ها را لخت کردیم (برای آشکار سازی هسته و سلول های بازوفیل لخت نمی شوند) هسته انها آشکار شده و توسط قانون های فلوسایتومتر تعدا لوبول های هسته و یا حالت دانسیته آنها مشخص و گزارش می شود . 


برچسب‌ها: سل کانتر, شمارنده سلولی
+ نوشته شده در  جمعه 1388/08/22ساعت 16:53  توسط امیر  | 

Related Posts Plugin for WordPress, Blogger...