علوم آزمایشگاهی | Lab sciences

علوم آزمایشگاهی ، مطالب آزمایشگاهی ، معرفی تکنیک ها و روشهای آزمایشگاهی برای شناسایی بیماری هاو ...

آنتی بیوگرام و آنتی بیوتیک

 
اریترومایسن ، پنی سیلین ، سولفونامید ، تتراسایکلین ، ونکومایسین و .... جز دسته ای بزرگ از ترکیبات شیمیایی هستند که باعث متوقف کردن رشد باکتریها (باکتریواستاتیک) و یا از بین بردن باکتری ها (باکتریوسیدال) در یک دوز پایین می شوند . در علم میکروب شناسی به این دسته از دارو ها که بروی باکتری ها اثر می گذارند آنتی بیوتیک می گویند . هر دسته از انتی بوتیک ها بر روی باکتری خاصی تاثیر دارد و این دارو ها بر روی ویروس و یا سایر میکروارگانیسم ها تاثیری نخواهند داشت . با این حرفا ،  این سوال در ذهن ایجاد می شود که ما از کجا بدانیم چه آنتی بیوتیکی بر روی چه باکتری هایی موثر است ؟ جواب سوال ما تست آنتی بیوگرام است که به صورت روتین در آزمایشگاه های میکروبیولوژِی انجام می گیرد . این تست به ما نشان می دهد که کدام یک از آنتی بیوتیک ها بر روی میکروب ما موثر است . همانطور که می دانید نمونه های گرفته شده برای بخش میکروبیولوژِی متفاوت هستند . اما نمونه ها هر چی که باشند (خون ، مایع مغزی-نخائی ، مدفوع ، ادرار ، خلط و..) در آخر  معمولا آنتی بیوگرام می شوند تا داروی موثر تجویز شود . در واقع باید بگوئیم که در عفونت های میکروبی آزمایشگاه دارو را تجویز می کند نه پزشک ... در این پست تقریبا هیچ نکته ای را قلم ننداختم و فکر کنم کامل است . منتظر نظرات شما هستم .

 خلاصه ای از پروسه آنتی بیوگرام دیسک دیفیوژن

بعد از کشت نمونه دریافتی در محیط کشت مناسب ، اگر شرایط مناسب باشد و باکتری در نمونه ما باشد ، باکتری موجود در نمونه رشد خواهد کرد . بعد از رشد باکتری ، از ان لام (مقداری نمونه + سرم فیزیولوژِی) تهیه می کنیم و رنگ آمیزی گرم انجام می دهیم . اگر باکتری ایزوله ما ، جز باکتری های پاتوژن باشد ، باید تست آنتی بیوگرام را انجام دهیم . مقداری از نمونه را برداشته و  در محیط کشت آنتی بیوگرام کشت می دهیم ، سپس دیسک های آنتی بیوگرامی را روی محیط کشت گذاشته و جواب را بعد از ۲۴ ساعت برسی کرده و نتایج را گزارش می کنیم .

  • بعد از معرفی ابتدایی آنتی بیوگرام ، وارد بحث تخصصی آزمایشگاهی می شویم .

اصول آنتی بیوگرام

اصول آنتی بیوگرام بر پایه دو اصطلاح میکروب شناسی است یعنی :

  • Minimum Inihibitory Concentration (MIC)
  • Minimum Bactericidal Concentration (MBC )

منظور از MIC ، غلظتي از يك آنتي بيوتيك است كه مي تواند رشد باكتري را در شرايط آزمايشگاهي مهار كند. و منظور از MBC ، حداقل غلظتي از دارو است كه باكتري را از بين مي برد. در اغاز باید بگم که باید آزمایش کننده چهار اصل زیر را قبل از آغاز آنتی بیوگرام مشخص کند :

  • Which organisms to test?کدام ارگانیسم برای تست                                                        
  •  
  • What methods to use?کدام روش تست                                                               
  •  
  • What antibiotics to test?کدام آنتی بوتیک  
  •  
  • How to report results? چگونگی گزارش نتایج

روش های مختلف انجام تست تعیین حساسیت داروئی

  • Disk diffusion (Kirby Bauer)
  • Broth micro-dilution MIC (NCCLS متد رفرنس)
  • Etest

وسائل و موارد مورد نیاز برای تست انتی بیوگرام "دیسک دیفیوژن"

  1. محیط کشت که آنتی بیوگرام بر روی آن انجام می شود که "آگار مولر هینتون" می باشد .
  2. لوله حاوی نیم مک فارلند .
  3. لوله حاوی یک سی سی سرم فیزیولوژِی استریل
  4. دیسک های انتی بیوگرام
  5. باکتری خالص در محیط کشت مناسب
  6. سواب ، انس ، شعله ، هود ، چراغ
  • محیط نیم مک فارلند

محیط نیم مک فارلند محیطی در تست آنتی بیوگرام است که میزان کدر بودن نمونه خود را با ان مقایسه می کنیم . این محیط حاوی ۱.۵*۱۰۸ باکتری است . نحوه تهیه این محیط در آزمایشگاه به شرح زیر است :

روش تهیه محیط نیم مک فارلند

این محیط به مدت ۶ ماه در تاریکی و در ظرف در بسته که به وسیله اتش بسته شده است می تواند مورد استفاده قرار گیرد . اما با این اوصاف ، اگر در هر زمان رسوبی در لوله مشاهده شد ، محیط غیر قابل استفاده خواهد بود . زمانی که می خواهیم از این محیط استفاده کنیم باید انرا به خوبی حل بزنیم و جهت مقايسه كدورت لوله كشت با لوله مك فارلند، استفاده از يك زمينه سفيد با خطوط سياه و نور كافي توصيه مي‌شود این اقدام بويژه جهت باكتريهايي مثل هموفيلوس، گنوكك و پنوموكك كه در محيط آبگوشت به خوبي رشد نمي‌كنند توصيه مي‌شود.

  • روش کار

روش های مختلفی برای تعیین حساسیت باکتری ها به انتی بیوتیک ها وجود دارد اما من در این قسمت تست روتین و ساده دیسک دیفیوژن (Disk diffusion ) را معرفی می کنم .

بعد از ایزوله کردن باکتری ، مقداری از کلونی باکتری را به وسیله انس (نه لوپ) برداشته و در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم . باید در نظر داشت که چون ، در تست آنتی بیوگرام میزان کدر بودن برای ما خیلی مهم است ، بنابراین در انتخاب مقدار نمونه باید دقت کنیم تا نمونه را بیشتر یا کمتر از نیم مک فارلند برنداریم . اگر میزان کدورت کمتر از نیم مکفارلند باشد ، مقداری دیگر از نمونه را در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم و یا اگر میزان کدر بودن ، بیشتر از نیم مک فارلند باشد در این صورت باید مقداری سرم فیزیولوژی استریل اضافه کرد تا به کدورت مناسب و برابر با نیم مک فارلند برسیم . بعد از تهیه محلول هموژن خود ، با سواب استریل محلول را به هم زده و بعد از آبکشی کردن سواب ، (برای آب کشی ، سواب را با قدرت به دیواره لوله تکیه داده و فشار دهید تا آب آن گرفته شود .) آن را به محیط کشت مولر هینتون انتقال می دهیم و به طور کامل به وسیله سواب ، محیط کشت را به صورت چمنی کشت می دهیم به طوری که هیچ محلی در محیط از قلم نیافتد  . بعد از کشت ، دیسک های انتی بیوگرام که قبل از نیم ساعت از تست ، بیرون یخچال قرار داده شده اند را انتخاب و بر روی محیط کشت انتقال می دهیم . باید ذکر کنم که نحوه قرار دادن دیسک ها در محیط کشت مولر هینتون ، به صورت دایره ای  است و فاصله این دیسک ها از هم دیگر حدود 12 میلیمتر باشد و باید از دیواره هم فاصله داشته باشند . در ضمن فاصله این دیسک ها را می توان با توجه به تجربه خود کم و یا زیاد کنیم . دیسک های مورد استفاده هم باید با نوع باکتری ایزوله شده ما مناسب باشد مثلا هیچ وقت برای باکتری گرم منفی ، پنی سیلین قرار نمی دهیم چون نسبت به آن مقاوم هستند و یا اینکه آنتی بیوتیک کلروامفینیکل را برای کشت ادرار قرار نمی دهیم چون این انتی بیوتیک نمی تواند وارد مجاری ادراری شود و... بعد از قرار دادن دیسک ها ، در پلیت را بسته و به مدت 24 ساعت آنها را در دمای 37 درجه سانتیگراد ، انکوبه می کنیم (لازم به ذکر است که بنابه به تحقیقات تازه محقین ، دمای انکوبه برای آنتی بیوگرام به ۳۵ درجه کاهش یافته است و مدت زمان آن هم به ۱۶ تا ۱۸ ساعت کاهش یافته است ) . بعد از 24 ساعت پلیت را زیر چراغ برسی می کنیم  .آنگاه مي‌بايد قطر هاله عدم رشد را با خط‌كش اندازه گيري کرد و با توجه به جدول همراه دیسک ها ، گزارش تست انتی بیوگرام خود را برای هر یک از انتی بیوتیک ها ، به صورت حساس (Susceptible ) ، مقاوم (Resistant) و یا نیمه حساس (Intermediate) گزارش می شود .

نحوه خواندن و گزارش کردن

بعد از انکوبه ، محیط ما باید به صورت زیر باشد :

آنتی بیوگرام

 

همان طور که مشاهده می کنید در اطراف برخی از دیسک ها هاله روش وجود دارد که این نشان دهنده حساس بودن ان بکتری به ان دیسک است و باید حساس گزارش شود . همچنین در اطراف بعضی از دیسکها هیچ گونه هاله ای نیست در این حالت این باکتری را باید نسبت به ان دیسک مقاوم گزارش داد . اگر طبق جدول خود هیچ یک از حالات فوق مشاهده نشود در اینصورت نیمه حساس را گزارش می کنیم .

و چند نکته مهم  :

  • در اندازه گیری از خط کش معمولی و یا ویژه این کار استفاده کنید .
  • همیشه امتداد خط کش باید از وسط دیسک عبور کند .
  • همیشه قطر اندازه گیری می شود .
  • باید در تست انتی بیوگرام ، نگاه بدبینانه ای داشت . یعنی اینکه کوتاهترین مسیر را برای تعیین حساسیت انتخاب می کنیم .
  • اگر در اطراف دیسک خط هایی کشیده شده باشد در این صورت باید از اخرین خطی که بعد از ان دیگر کلونی نیست تعیین حساسیت کرد.
  • اگر در اطراف دیسک حتی یک کلونی هم باشد باید از همان جا تا دیسک را اندازه گیری کرد نه کل هاله را .
  • همیشه به محل هاله دقت کنید بازم می گم همیشه و کوتاهترین مسیر ار انتخا کنید .
  • دیسک ها و هاله ها را در زیر نور برسی کنید .

 محيط كشت در آنتي بيوگرام

محيط مورد استفاده در روش دیسکی مولرهينتون است كه بايد pH آن بين 4/7-2/7 تنظیم شده باشد .
و در پليت به قطر 100 ميلي متر حدود 30-25 ميلي ليتر محيط مولر هینتون میریزیم و قطر مورد نظر حاصل مي‌گردد. جهت اجتناب از خشك شدن سطح محيط بايد پليتها را در كيسه‌هاي پلاستيكي نگهداري نمود.پس از تلقيح محيط آنتي بيوگرام در فاصله حداكثر 15 دقيقه مي‌بايد ديسكهاي آنتي بيوتيك را در سطح آگار با فاصله مناسب از يكديگر  قرار داد.سپس به مدت 18-16 ساعت در انكوباتور 35 درجه سانتي‌گرام نگهداري نمود. روشهای اصلاح شده در باکتریهای سخت رشد نیز یکی دیگر از روش ها است در بعضی از باکتریهای سخت رشد از محیط های کشت اختصاصی استفاده می شود مانند : محیط کشت HTM در هموفیلوس ها .
 
نکات بسیار مهم در آنتی بیوگرام
  • تست همیشه در زیر هود و در کنار شعله انجام شود .
  • باکتری ایزوله شده باید ، خالص رشد کرده باشد .
  • در زمان برداشت نمونه باید سعی شود که از یک کلونی برداشت شود .
  • قبل از انتقال سواب به محیط کشت مولر هینتون ، محیط کشت را از عدم رشد کلونی های باکتری در محیط کشت مولر هینتون برسی کنیم . اگر کلونی در محیط کشت دیده شد ، محیط را عوض می کنیم .
  • همیشه به وسیله انس نموه را برداشته و سپس به لوله حاوی سرم فیزیولوژی استریل اضافه کنید .
  • برای اینکه به کدروت مورد نظر نیم مک فارلند دست یابید ، از مقادیر کم کلنی شروع کنید و یا کلونی را ابتدا به دیواره لوله انتقال دهید و سپس کم کم کلونی را به محیط آبگوشت اضافه کنید تا به کدورت مورد نظر دست یابید .
  • همیشه بعد از باز کردن در لوله و بعد از بستن ان ، سر لوله را در معرض شعله قرار دهید .
  • اگر پنبه سر لوله ها ، به سطح هود افتاد باید آنها را دور انداخت .
  • اگر سوآب را به خوبی آب گیری نکنیم در این صورت به علت تبخیر مایع بالایی در انکوباسیون ممکن است رطوبت در سر طرف مولر هینتون قرار گیرید .
  • همیشه بعد از اینکه محیط کشت را با سواب کشت چمنی دادیم ، سواب را به ظرف حاوی مواد ضد عفونی یا استریل کننده انتقال دهیم .
  • اگر نمونه مورد نظر ما مشکوک به سودوموناس است (بوی شبیه گل یاس) در این صورت سواب را ایتدا در روی ضعله قرار دهید و سپس به محیط ضد عفونی کننده انتقال دهید .
  • هیچ وقت سواب را به دور محیط کشت حرکت ندهید .
  • همیشه قبل از باز کردن محیط کشت ، سر پلیت را با ضعله ضد عفونی کنید .
  • برای راحتی کار ، ایتدا دیسک ها را بر روی پلیت تعیین مکان کنید و سپس به محیط اضافه کنید .
  • تا زمانی که دیسک ها را در روی محیط مولر هینتون ، فشار نداده اید می توانید جای انها را تغییر دهید . اما بعد از فشار هیچ وقت نباید آنها را تغییر داد .
  • همیشه دیسک ها را از بالا توسط یک گیره به محیط اضافه کنید .
  • فبل از گذاشتن دیسک سعی شود که هر دو طرف را برسی کنید تا اگر دیسک حاوی نام نباشد ، از به کار گیری ان خودداری کنید .
 
خطا های تست انتی بیوگرام
  • اگر بیشتر از یک کلونی برداشت شود ، نتیجه تست ما کلا اشتباه خواهد بود . چون در این صورت با تست آنتی بیوگرام ، چند کلونی را از نظر حساسیت برسی کردیم که ممکن است یک کلنی حساس باشد و دیگری نه . پس دقت شود .
  • اگر محیط کشت ما بعد از انکوبه ، به صورت خط خطی باشد نشان دهنده این است که مقدار کلونی ماکمتر از نیم مک فارلند بود .
  • اگر در دور تمام دیسک ها هاله تشکیل شد و یا در اطراف هیچ یک از دیسک ها هاله ای تشکیل نشد برای برسی نتایج باید تست را تجدید کرد .
  • اگر PH محیط مولر هینتون مناسب نباشد نتایج ما اشتباه خواهد بود .
  • نگه داری غلط دیسک ها و استفاده از محیط های تاریخ گذشته موجب خطا می شود .
  • تهیه اشتباه محیط نیم مک فارلند هم میتواند باعث اشتباه شود .
  • تأخير زياد بين استاندارد كردن كدورت كشت و تلقيح پليت
  •   همراه بودن سواب با مقدار زيادي مايع آبگوشت به هنگام تلقيح محيط آنتي بيوگرام (نگرفتن مايع اضافي با جدار لوله)

این نکته ها یادم بود اگه بازم یادم اومد اضافه می کنم

  • دیسک های مورد استفاده در آنتی بیوگرام

همان طور که در بالا هم گفتم ، باید از دیسک های مناسب باکتری ایزوله شده استفاده کرد . انتخاب نوع دیسک ها بسیار مهم است چون از یک طرف باید قضیه مقاوت داروئی را در نظر بگیریم و از طرف دیگر باید سلامت فرد را هم در نظر بگیریم برای نمونه :

بسیاری از باکتری ها کم کم به آنتی بیوتیک ها مخلفت مقاوم می شوند که این می تواند عمر آنتی بوتیک ها را کم کم به سوی افول هدایت کند .

و یا اینکه مصرف خود سر و یا اضافی که حاصل اشتباه فردی و یا اشتباه تکنیکی در تست انتی بیوگرام است می تواند عوارض گوناگونی داشته باشد . مثلا استفاده زیاد از سولفونامید ها باعث بیماری های عصب شنوایی و یا بیماری های کلیوی خواهد شد و یا اینکه مصرف زیاد پنی سیلین باعث تروبوسایتوپنی و مصرف زیاد تتراسایکلین باعث گرانولوسیتوپنی خواهد شد .

  • نگهداری دیسک ها : دیسک ها باید در یخچال و یا در فریز نگه داری شوند . اگر دیسک ها به صورت STOCK هستند در دمای فریز باید نگه داری شوند اما دیسک ها به صورت روتین تا یک ماه در دمای یخچال نگه داری می شوند .
  • کنترل کیفی :  به كمك سوشهاي استاندارد و با مراجعه به جدول مربوطه مي‌بايست نسبت به كنترل كيفي روند آنتي بيوگرام اقدام نمود.

چند نکته :

اگر باکتری ایزوله شده کوکسی گرم مثبت مانند استافیلوکوک طلائی (اورئوس) باشد در این صورت دو دیسک کلیندامایسن و اریترومایسن را در کنار هم و مقداری نزدیک تر قرار می دهیم . چون کلیندمایسن باعث می شود تا ژن القا کننده در اریترومایسن فعال شود . در واقع دیسک کلیندمایسن فعال کننده ژن خاموش اریترومایسن است .

  • آمینوگلیکوزید ها بر روی باکتری های بی هوازی تاثیر می گذارند .
  • کلروامفینیکل در نمونه ادراری استفاده نمی شود چون وارد ادرار نمی شود .
  • ونکومایسن ، اریترومایسن ، کلیندمایسن ، پنی سیلین و چند تا دیگه بر روی باکتری های گرم مثبت تاثیر می ذارند .
  •  دیسک ایمیپنم هم برروی گرم مثبت و هم بر روی گرم منفی تاثیر دارد ولی باید در عفونت های شدیدی استفاده شد تا مقاومت ایجاد نشود .
  • سفالکسین که بر روی گرم مثبت و منفی تاثیر دارد به صورت خوراکی است .
  • تتراسایکلین آنتی بوتیک وسیع الطیفی است و معمولا به صورت موضعی استفاده می شود .

در اخر هم باید ذکر کنم که دیسک ها را بر اساس نوع بیمارستان و یا نوع محل تست می توان تغییر داد و یا مکان و فاصله انها را هم تغییر داد و این که بسیاری از مراحل تست به صورت عالی انجام گیرند باید تجربه کافی داشت و همیشه سعی کنید که به بهترین نحو کار خود را انجام دهید .

این مطالب حاصل تجربه کاراموزی من در بیمارستان کودکان و اطلاعات تئوریم بود و بس .....منتظر نظرات شما دوستان هستم ...

تشکر و موفق باشین

 


برچسب‌ها: آنتی بوگرام, تست حساسیت داروئی, تست انتی بیوگرام
+ نوشته شده در  چهارشنبه 1388/09/04ساعت 18:15  توسط امیر  | 

Related Posts Plugin for WordPress, Blogger...